基礎(chǔ)研究
mTOR抑制劑對癲癇大鼠免疫微環(huán)境的影響
謝撲松 何金水 周火旺
【摘要】 目的 探討mTOR抑制劑對癲癇大鼠血液和腦組織免疫微環(huán)境的影響。方法 選用40只癲癇大鼠,隨機分為4組,每組10只,空白對照組(生理鹽水干預(yù)),不同劑量mTOR抑制劑(雷帕霉素)干預(yù)組:低劑量組[1 mg/(kg?d)],中劑量組[2 mg/(kg?d)] ,高劑量組[4 mg/(kg?d)]。分別進(jìn)行為期8周的干預(yù),8周后處死大鼠,保留大鼠血清及腦組織樣本。經(jīng)ELISA法檢測大鼠血清IL-2、IL-10和IFN-γ水平。經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢測大鼠腦組織的T細(xì)胞亞群。
【關(guān)鍵字】 癲癇,mTOR抑制劑,大鼠,免疫微環(huán)境
中圖分類號:文獻(xiàn)標(biāo)識碼:文章編號:
Objective To determine the influence of rapamycin intervention on epileptic rats blood and the brain tissue immune microenvironment. Methods A total of 40 epileptic rats were used in the study and randomly divided into 4 groups (n=10). The blank control group with normal saline intervention, and with different doses of rapamycin: low-dose group [1 mg/(kg?d)], medium-dose group [2 mg/(kg?d)], high-dose group [4 mg/(kg?d)]. Rats in the four groups went through intervention for 8 weeks. After 8 weeks, the rats were sacrificed, rat serum and brain tissue samples were reserved. The ELISA method was used to test peripheral blood (PB), IL-2, IFN-γ and IL-10 levels. Flow cytometry was used to test the state of T-cell subsets.
癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一,癲癇的發(fā)作給患者造成巨大的生理和心理創(chuàng)傷,同時給患者帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。癲癇的發(fā)病機制目前尚未完全明確。有研究表明,癲癇的發(fā)生與膠質(zhì)細(xì)胞增生、神經(jīng)元凋亡、免疫炎性反應(yīng)以及異常通路形成密切相關(guān)[1]。有研究證實,大腦的炎性反應(yīng)和免疫損傷在癲癇發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[2]。許多研究數(shù)據(jù)顯示激活mTOR信號通路可在遺傳性和獲得性癲癇所起的重要作用[3]。mTOR作為信號級聯(lián)的中央節(jié)點影響免疫微環(huán)境中各種信號的輸入,調(diào)節(jié)各種免疫細(xì)胞,包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞以及APC等細(xì)胞的分化發(fā)育,并影響其功能活性[4]。雷帕霉素是一種mTOR抑制劑,可通過不同的細(xì)胞因子影響信號傳導(dǎo),從而阻斷T細(xì)胞由分化進(jìn)程,發(fā)揮免疫抑制的作用。目前,雷帕霉素干預(yù)癲癇模型探討癲癇發(fā)病機制的研究甚少。本研究通過建立癲癇大鼠模型,用不同劑量雷帕霉素和生理鹽水干預(yù)后,觀察大鼠外周血和腦組織T細(xì)胞亞群以及IL-2、IFN-γ和IL-10含量的變化,探討雷帕霉素干預(yù)對大鼠血液和腦組織免疫微環(huán)境的影響。
1 材料與方法
1.1材料 將8周齡SPF級雄性大鼠進(jìn)行癲癇建模。研究選用40只建模成功的大鼠,無水氯化鋰(北京索萊寶科技有限公司),鹽酸毛果云香堿(阿拉丁),雷帕霉素(中國上海源葉生物科技有限公司)、IL-2、IFN-γ和IL-10試劑盒(R&D SYSTEMS)、RAT CD3、RAT CD4、RAT CD25試劑盒(BD),流式細(xì)胞儀、離心機和光學(xué)顯微鏡。本研究經(jīng)廈門大學(xué)實驗動物管理與倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批號XMULAC20220008)。
1.2方法 將40只癲癇大鼠隨機分為4組,每組10只,空白對照組(生理鹽水干預(yù)),不同劑量mTOR抑制劑(雷帕霉素)干預(yù)組:低劑量組[1 mg/(kg?d)],中劑量組[2 mg/(kg?d)],高劑量組[4 mg/(kg?d)]。干預(yù)8周后頸脫位處死。取全血5 mL,4 ℃離心10 min,血清保持在-20 ℃。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測大鼠血清IL-2、IL-10和IFN-γ。取額葉腦組織5 g,用電動勻漿器制成組織勻漿,靜置、離心,取上清液保存-80 ℃冰箱備用。分離單個核細(xì)胞經(jīng)RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整,將其置于24孔板內(nèi),每孔1 mL。置于孵箱中孵育培養(yǎng),將細(xì)胞懸于100 μL PBS中,加入標(biāo)記的CD3、CD4和CD25抗體5 μL,室溫避光反應(yīng)15 min。用PBS洗滌2次,并將細(xì)胞懸于300 μL PBS內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。
1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗,滿足正態(tài)分布,采用單因素ANOVA分析;不滿足正態(tài)分布,采用非參數(shù)檢驗;P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2.1 ELISA實驗 每組預(yù)計檢測10只,共4組,但在取樣前共有5只大鼠死亡。正常大鼠(未使用生理鹽水或者mTOR抑制劑干預(yù)的大鼠)檢測了1只。
2.1.1 IL-2檢測 檢測結(jié)果如表1,根據(jù)標(biāo)曲y=0.0008x+0.3329(R2=0.9913)計算得到各組大鼠的IL-2含量。正常大鼠IL-2含量為-27.4 pg/mL。行正態(tài)性檢驗發(fā)現(xiàn)中劑量組不滿足正態(tài)分布,采用非參數(shù)檢驗,P>0.05,IL-2的表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。